iPS细胞存在基因突变,会不会导致癌症风险?

2022/09/22

近日,一项迄今为止最大的iPSC基因组学研究发表于Nature Genetics上,并因一篇某公众号标题为“iPSC应用再次蒙上阴影,剑桥大学证实近四分之三的iPSC细胞系DNA受到严重损伤”的文章而引起了国内一些受众的不安和关注,担心会对iPSC临床转化造成负面影响。安全警示固然重要,但正确的科普和求真负责的态度也很重要。让我们先来了解一些细胞和基因突变的常识,然后也一起看看在该研究原文中,英国剑桥大学和桑格研究所的研究人员到底讲的是什么。

基本常识

首先,先来普及一些细胞和基因突变的基本常识:


1. 人体内的细胞在正常细胞分裂的每次DNA复制中,包括受日常UV照射、氧化损伤等均有一定机率出现染色体DNA突变,也叫体突变(somatic mutation),一般以单碱基差异(突变)Single Nuclei Variation(SNV)为主之所以原本叫差异(variation)而不叫突变(mutation)是因为在大量人基因组测序中,发现不同人种、族群甚至个体的许多基因有很多基因序列的差异,包括很多单碱基差异,但基本不影响基因功能,或者不影响个体生理或健康,由于无法定义哪个版本是标准的序列,也就无法定义哪些是突变。


2. 实际上人体组织或者人本身就是一个杂合体(Mosaicism),因为人体的不同细胞拥有所积累的不同的基因组DNA体突变。体突变是相对于胚系突变(germline mutation)而言的在全基因组测序中,个别细胞的体突变在所测的上千细胞中的比例(频率)可以类似0.1%、30%等不同,但胚系突变一般为50%(单条染色体)或100%(两条染色体)。


3. 就如同我们初中和高中的生物课的遗传学基础里所学,即使是胚系遗传突变,也有许多突变由于在非编码区、或属于编码一致的同义突变、或位于基因的一些不影响最终所翻译蛋白功能的区域,不影响性状,或者是仅在沉默的染色臂上不会被转录(隐形、显性)。体突变也是如此,并且由于体突变只在一些细胞中存在,而不像胚系突变在所有细胞中都携带,即使属于功能突变,也主要影响携带突变的少量细胞,而不一定会导致组织或个体的异常。


4. 是否体外培养细胞和传代会导致更多的细胞DNA体突变?是的,只要有细胞分裂或细胞会受到氧化损伤、UV照射等,就会产生体突变。


5. 是否只要细胞有DNA突变就代表会致病或造成癌症?不一定,细胞和机体有一系列的纠错机制和保护设置帮助对抗这些随机错误。1)许多突变不一定影响了肿瘤相关基因(细胞周期相关基因等)的表达和功能;2)即使是肿瘤相关基因的DNA功能突变,无论是DNA复制或非分裂细胞的DNA氧化损伤造成,首先有DNA聚合酶、碱基错配修复等多重机制对DNA(包括线粒体DNA)损伤进行修复,当突变不可修复或太大量会启动细胞的自杀程序促使细胞凋亡;其次当这些机制失灵时,如果有突变是导致某些重要基因的某处染色体上的拷贝无法表达,通常重要的基因会有其他冗余备份的拷贝可以弥补表达;再次在一些突变导致的蛋白出现错误时影响其折叠或结构,也有高尔基体等“质控部门”帮助检查出错误蛋白并送去溶酶体等部门进行降解(报废品处理);再再次即使有错误的蛋白到达岗位,也有许多肿瘤抑制的信号通路对这些错误信号进行控制和纠正;最后如果所有这些机制都没有能达到效果,当细胞出现异常不受控的分裂时,机体会有免疫系统“纠察队”监视和启动扑灭这些细胞的程序。只有当所有以上程序和机制全部都失败,才会有恶性肿瘤或癌症出现的风险。


6. 衰老是癌症的最正相关的影响因素,也是由于衰老后细胞的抗氧化及DNA纠错修复等机制,以及机体的免疫机能等在衰退,所以当有细胞出现或积累肿瘤相关突变后,更容易形成肿瘤。


7. 优势突变一般是指一些DNA突变由于导致细胞具有分裂或存活的更大优势,或者说有选择优势,而在一个细胞群体中的频率逐步升高,最后变成该群体的共有突变。



文章解析

让我们回到这篇Nature Genetics的研究文章,从其他引用文献及研究人员利用深度全基因组测试技术检测健康人皮肤或血液EPC来源的不同iPSC系的发现可知:


1. 即使是来自于胚胎发育最早阶段的ESC(胚胎干细胞),也有多篇文献报道发现由于体外培养压力携带TP53这样的突变和染色体异常;但也有文献报道临床级ESC的突变率很低且没有肿瘤相关突变。


2. iPSC所携带的体突变主要(95%以上)来源于重编程所来源的体细胞。


3. 皮肤或血液EPC来源的不同iPSC系在染色体异常(结构性异常)层面没有差异,但72%的皮肤来源iPSC的体突变主要为UV照射相关突变,而血液EPC来源的iPSC的体突变主要是来源于氧化损伤(ROS)


4. 皮肤来源不同iPSC单克隆的体突变频率差异较大,可以相差10倍,有的克隆完全没有UV相关的体突变,可能与所取皮肤组织被重编程的具体单个成纤维细胞的部位有关。因此,全面的基因组分析和单克隆的筛选非常重要,这也是为什么同一次重编程获得的iPSC单克隆细胞株之间差异非常大的原因。


5. 皮肤来源的iPSC克隆性较高(也即来自于单个细胞克隆,后续继续传代,子代之间突变差异较小),而皮肤成纤维细胞的异质性较高(多克隆性)。


6. 正常人体组织中的细胞也有一些肿瘤相关基因突变,但不表现异常或未发展为肿瘤。


7. BCOR突变是唯一找到的与选择压力相关的突变,可能导致血液肿瘤AML等疾病,出现的频率在血液EPC来源的iPSC中要明显高于皮肤来源的iPSC(约四分之一携带)。进一步研究发现,BCOR突变主要是在成血细胞(erythroblast)的体外培养(重编程前)和重编程后的细胞培养中受选择压力影响而不断产生的。


8. BCOR突变在皮肤来源的iPSC中比较少见,且没有在成纤维细胞中发现,提示该突变的压力选择可能和不同细胞的培养条件有关。


9. 带有BCOR突变的iPSC向神经分化的能力受到影响,更倾向于中胚层分化。


10. iPSC与源头体细胞差异的获得性突变主要由培养中的氧化损伤造成,且与传代次数正相关,这与其他非iPSC细胞株,包括ESC等是一致的。



文章解析

早在2016年,另一项发表在Plos Genetics杂志上的研究(同样来自英国剑桥大学和桑格研究所)就对iPSC中的基因突变谱系历史进行了追踪,主要结论摘录如下:


1. 体细胞(血液EPC)每个细胞每次传代平均增加14个SNV突变,而iPSC大约为0.8-1.2个,H9 ESC大约为1.7个,仅为体细胞突变每代增加突变数量的十分之一。也即,iPSC和ESC传10代所积累的突变约等于体细胞传代一代的突变数量。推测这与iPSC和ESC的多能状态(分裂的DNA复制方式、高DNA纠错水平)等有关。


2. 没有在所分析的任何一个iPSC系的DNA突变中发现有选择优势的突变。




最后我们来了解一下霍德是如何建立一株临床级iPSC细胞株的(仅克隆筛选和基因组稳定性安全性策略相关部分):


1. 首先,经过供者筛查的健康捐赠者无论皮肤或血液细胞经过必须的扩增培养后进行一定的质量控制和冻存,一部分细胞用于重编程;


2. 重编程得到一般500以上单细胞或多细胞克隆,挑选合适的多个克隆进行一定扩增后再次挑选单克隆;


3. 获得30-100个单克隆后扩增冻存,选择部分克隆分批进行WGS及WES测序,通过已建立的分析方法与多个数据库比对后没有肿瘤致病突变或其他和分化产品相关突变的iPSC细胞株,才算达到初步的质控标准,才会进行下一步的质控,优选的细胞株将进行分化/生产测试,最终优选的细胞株将用于建立细胞库。


4. 建立细胞库后,不同级细胞库以及分化的终产品还会再进行WGS及WES测序,包括细胞库进行传代稳定性研究,没有异常致病突变,这样的细胞库才能用于临床级细胞产品的生产。细胞产品进行冻存后,只有达到所有的放行质量标准,通过体内外的各种安全性、成瘤性、致瘤性研究(免疫缺陷动物评估长达1年以上)后才能申报用于临床。

所以,相对于没有办法做到足够把控的原代体细胞产品,或基因编辑、慢病毒感染随机插入基因组等类型的工程化细胞产品(因产品的细胞异质性和稳定性时间有限,无法冻存等限制),iPSC或ESC来源的细胞产品无论从产品批次的一致性、稳定性还是基因组的安全可控性上来说其实是更高的。



综上所述,对于iPSC衍生细胞治疗产品开发的企业和研发人员来说,重视和采取相应的单克隆筛选措施和质量控制等对iPSC及其产品的基因组稳定性和安全性进行监控和把控是常规需要做到的。当然,另一方面也提示了即使是iPSC非临床应用的研究者们也应注重iPSC的克隆筛选和全基因组测序分析,尤其是一些遗传性疾病的细胞模型或基因编辑后用于疾病机制研究的细胞株,如果没有进行全面的基因组分析,一些来源细胞的体突变可能会影响iPSC向某些谱系细胞的分化和表型,从而得出错误的结论。

自2014年以来,ESC和iPSC衍生的不同种类细胞的临床转化在全球范围内都有陆续展开,目前经过严格的质量和安全性把控,正规的注册制审批或备案进入临床的品类并未有在人体内成瘤的报道。这也从侧面说明克隆的选择、工艺的成熟度、完善的质控和足够长时间的安全性、成瘤性评价对于这一类型产品临床安全的重要性和必要性。

霍德生物针对iPSC及细胞产品开发了:1)全基因组测序检测细胞遗传稳定性及安全性的分析方法;2)终产品中多能干细胞残留的数字PCR检测方法(目前可达百万分之四的检测灵敏度);3)终产品scRNAseq单细胞转录组测序检测细胞组成的分析方法等平台检验分析方法和对应的企业标准。除体外克隆形成实验、《中国药典》法的裸鼠成瘤实验外,免疫全缺陷小鼠的长期成瘤致瘤实验符合FDA申报要求的1年以上观察,均是为了最大程度地保证终产品的质量和安全性。

纵观整个细胞治疗领域,iPSC衍生细胞产品因有望解决细胞来源和批量化生产、稳定性、一致性、安全可控、成本可及等一系列的成药性的挑战,并且在已进行的多项临床试验中展现出良好的长期安全性和针对多种包括难治性疾病的有效性,正在逐步走向商业化。希望更多像这样有价值的研究能被正确、公正地传达给普通受众,让大家理解这一领域的发展和优势,并带着审慎而乐观的态度助力这些细胞药物更早惠及目标患者人群。

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